Sur une mer d'huile, un esquif dérive. À son bord, de pauvres hères en quête de reconnaissance attendent, quasi inanimés, du renfort. Ces infortunés ne sont pas les naufragés de La Méduse avant le secours de l'Argus, mais des protéines ballottées à la surface d'une cellule. Leur « embarcation » est constituée de lipides (des graisses, tels que des acides gras) distincts de ceux qui constituent le reste de la membrane, la mer. La découverte récente de ces radeaux s'inscrit dans une révision plus générale de notre conception de la membrane cellulaire et nous a conduits à réexaminer comment protéines et lipides coexistent dans une telle bicouche lipidique. Si plusieurs travaux ont mis en évidence des microdomaines lipidiques, des radeaux, qui se déplacent sur la mer démontée qu'est la membrane cellulaire, cette hypothèse reste néanmoins controversée, notamment en ce qui concerne la taille de ces plateformes. Quoi qu'il en soit, les nombreux travaux sur les radeaux nourrissent un débat des plus stimulants, car de nombreux mécanismes fondamentaux s'éclairent grâce à ce nouveau concept biologique. En décrivant le rôle des radeaux lipidiques dans plusieurs de ces mécanismes, nous verrons que leur tâche essentielle consiste à stabiliser des complexes moléculaires dont les éléments seraient dispersés en l'absence de radeaux : ils augmentent ainsi la probabilité des réactions où interviennent ces complexes. Enfin, l'étude de divers agents pathogènes (virus, parasites et bactéries), dont l'ingéniosité pour détourner à leur profit les mécanismes cellulaires est sans limite, semble confirmer l'existence des radeaux lipidiques. Nous vous proposons un voyage dans un système très dynamique, les membranes biologiques. En route pour le rafting…
Composition et propriétés fondamentales de la membrane biologique
Chaque cellule est définie par la barrière sélective qui constitue sa frontière vis-à-vis de son environnement : la membrane plasmique. Par ailleurs, la plupart des cellules eucaryotes et certaines cellules procaryotes possèdent également des membranes délimitant des compartiments intracellulaires, permettant une compartimentation supplémentaire. Les membranes biologiques permettent la réalisation d’un grand nombre de fonctions (informatives, métaboliques, structurales), adaptées aux besoins de la cellule et aux conditions de son environnement. La membrane plasmique des érythrocytes (globules rouges) des Mammifères, cellules qui n’ont pas d’autres membranes, a été extensivement étudiée, et a servi de modèle pour établir la structure plus générale des membranes biologiques. Elle comporte des protéines, des lipides et des glucides liés à des protéines ou des lipides. En masse, les lipides représentent environ 40 % des composants membranaires (environ 60 % pour les protéines). Dans l’espace, les lipides occupent 70 à 90 % de la surface membranaire. En nombre, les lipides représentent environ 98 % des composants membranaires.
Les lipides membranaires ont des structures diverses et complexes, et leur organisation dans une membrane biologique conditionne l'activité cellulaire. Plus de la moitié sont des phospholipides : soit des esters de glycérol, d’acides gras et d’acide phosphorique (glycérophospholipides), soit des amides de sphingosine et d’un acide gras, estérifiés par un acide phosphorique (sphingolipides). Ils sont dotés d'une tête hydrophile, qui « recherche » le contact avec le milieu aqueux, et d'une queue hydrophobe, qui l'évite : une configuration satisfaisant toutes les parties est la bicouche lipidique, où les lipides constituent deux feuillets accolés par les queues hydrophobes, les têtes hydrophiles étant dirigées vers l'extérieur. La queue hydrophobe est constituée de chaînes d'acides gras de longueur variable, dont la rigidité diffère selon le nombre de liaisons saturées. Rappelons que plus un acide gras est saturé - en hydrogène -, plus la molécule est souple, car plus elle contient de liaisons simples dont les extrémités sont autant d'articulations (les doubles liaisons empêchent les rotations). Bien que de structure différente, le cholestérol, qui est lui aussi un lipide membranaire, s'insère dans la membrane de la même façon, sa partie hydrophile vers l'extérieur et sa partie hydrophobe vers l'intérieur. Il existe aussi environ 30 % de stérols membranaires, dont le cholestérol des membranes animales, le sistostérol des végétaux, et l’ergostérol des Eumycètes. Ils sont composés d’un noyau polycyclique lié d’un côté à une courte chaîne carbonée et de l’autre à un groupe hydroxyle −OH (fonction alcool). Ces propriétés expliquent que des lipides membranaires s’assemblent (principalement) en bicouche dans un solvant polaire comme l’eau : ils forment deux feuillets, qui délimitent deux bordures hydrophiles et une couche centrale hydrophobe.
De la mosaïque fluide aux microdomaines ordonnés
En 1972, Jonathan Singer et Garth Nicholson proposèrent le modèle de la mosaïque fluide pour représenter la membrane cellulaire. Dans ce modèle, les protéines enchâssées dans la membrane ressemblaient à des icebergs dérivant à la surface d'une mer lipidique. Cette dernière (semblable à une phase fluide désordonnée) et divers constituants cellulaires, tel le cytosquelette présent sous la membrane plasmique, limitaient leur diffusion. L’aptitude des constituants membranaires à diffuser latéralement, proposée dans ce modèle, supposait une distribution homogène des lipides. Cependant, des analyses microscopiques ont mis en évidence, à la surface des cellules, plusieurs types de régions qui se distinguent du reste de la membrane ; leur dynamique diffère, ce qui met à mal la vision précédente d'une membrane plasmique cellulaire, certes complexe, mais passive. Pour étudier ces structures, les biologistes ont utilisé des membranes artificielles et ont observé trois types d'organisation de la bicouche lipidique, ou phases, déterminés par les conditions du milieu. Dans la première phase, nommée gel, obtenue par refroidissement, les lipides n'ont aucune liberté de mouvement. Dans la deuxième phase, dite fluide, les lipides diffusent dans le plan de la membrane et sont très mobiles les uns par rapport aux autres. Enfin, il existe une phase fluide particulière où les lipides sont ordonnés, comme dans un gel, mais conservent leur mobilité. Cette dernière phase, compatible avec les conditions physiologiques, intéresse les biologistes, car les complexes lipidiques et protéiques seraient « stabilisés » dans de telles conditions.
L'hypothèse d'une compartimentalisation des lipides dans les membranes - l'idée des radeaux lipidiques - fut proposée en 1988 par Kai Simons et Guerrit van Meer. Ils se fondèrent sur des travaux montrant que, dans des membranes artificielles, des sphingolipides s'assemblent parfois par des liaisons hydrogène et sur deux observations biologiques cruciales. Premièrement, les protéines ancrées au feuillet externe de la bicouche par un groupe glycosyl phosphatidylinositol (des chaînes d'acides gras), ou GPI, et donc sans relation directe avec des systèmes internes, sont uniquement situées sur la face apicale des cellules épithéliales. Deuxièmement, cette même face apicale est enrichie en certains lipides par rapport aux autres faces des cellules : les sphingolipides glycosylés (ou glycosphingolipides) et le cholestérol. Faisant preuve d'une remarquable intuition, les biologistes avancèrent la notion de radeaux (une phase fluide ordonnée) « flottant » dans la membrane (une phase fluide désordonnée). Ces radeaux, constitués de sphingolipides et de cholestérol, autorisent la formation de plateformes où des protéines, telles les protéines à ancre GPI, sont situées préférentiellement.
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Asymétrie et dynamique des feuillets membranaires
Une membrane biologique maintient une asymétrie de lipides et de protéines entre les feuillets externe et interne. En effet, le feuillet externe est enrichi en lipides glycosylés (« décorés » de sucres) et à chaînes d'acides gras saturés, alors que le feuillet interne est plutôt constitué de lipides à chaînes d'acides gras insaturés. Toute rupture de cette hétérogénéité a de graves conséquences. Par exemple, lors de l'apoptose - la mort programmée des cellules -, des lipides du feuillet interne (des phosphatidylsérines) passent dans le feuillet externe où ils deviennent un signal d'élimination de la cellule. In vivo, pour la membrane plasmique, on parle de feuillet cytosolique (ou interne) et de feuillet extracellulaire (ou externe). Pour les vésicules et organites, on parle de feuillet cytosolique et de feuillet luminal (côté lumière). La structure des membranes biologiques dépend de liaisons non covalentes entre composés membranaires (liaisons de Van der Waals, liaisons hydrogènes entre stérols et phospholipides, etc.) et avec le solvant (interactions électrostatiques, dont les liaisons hydrogènes).
Les énergies de liaison de ce type d’interactions sont du même ordre de grandeur que l’énergie cinétique due à l’agitation thermique des molécules membranaires, ce qui aboutit à une grande labilité : les liaisons faibles se forment et se brisent constamment au sein de la membrane, et entre la membrane et le solvant aqueux. Par conséquent, la structure globale des membranes reste stable, mais les composants membranaires sont mobiles les uns par rapports aux autres dans le plan des membranes. Cependant, les vitesses de diffusion latérale mesurées dans des membranes biologiques sont jusqu’à 100 fois inférieures à celles mesurées dans des membranes artificielles (liposomes). De plus, différents composés membranaires n’ont pas les mêmes vitesses de diffusion latérale dans une membrane. L’existence d’une compartimentation latérale de protéines et lipides membranaires est désormais vérifiée pour les membranes plasmiques animales et végétales. Les radeaux lipidiques consistent en un rassemblement en un point précis de plusieurs protéines membranaires, lorsque ces dernières reconnaissent un ligand extracellulaire. Ce rassemblement est stabilisé par l'accumulation au même point de cholestérol et de lipides rigides, comme les glycosphingolipides. Traditionnellement, les radeaux lipidiques sont vus comme une structure englobant les deux feuillets d'une membrane. Néanmoins, les membranes sont asymétriques et les feuillets en partie découplés. La composition du feuillet externe de la membrane plasmique correspond à une phase prédite comme ordonnée, et la diffusion latérale y est réduite par l'abondance des interactions entre stérols et glycosphingolipides. La structure plane des stérols, et les longs acides gras saturés des sphingolipides, permettent l’établissement de nombreuses liaisons de Van der Waals qui s’opposent aux mouvements horizontaux de lipides.
Caractérisation biochimique et structurelle des radeaux
Le principal écueil de l'hypothèse des radeaux est la visualisation de ces domaines, rendue difficile par leur taille, toujours en deçà des limites de la microscopie optique, et par leur dynamique. En 1992, Deborah Brown et John Rose ont fourni le premier argument biochimique en faveur de l'existence des radeaux. Les membranes lipidiques sont solubilisées à froid par des détergents, mais certaines membranes biologiques résistent partiellement à ce traitement : les sphingolipides ne sont pas solubilisés dans ces conditions, contrairement aux phospholipides insaturés qui constituent la majeure partie des membranes biologiques. L'analyse des fragments de membranes résistant aux détergents révéla la présence de sphingolipides, de cholestérol et de protéines à ancre GPI, c'est-à-dire les constituants des radeaux lipidiques. Cependant, cette technique est assez grossière, car elle entraîne la coalescence de tous les radeaux de la cellule que l'on isole dans la fraction résistant au détergent. Plusieurs techniques biochimiques et biophysiques permettent d'étudier les radeaux, mais les sensibilités différentes ont empêché l'établissement d'un consensus sur la taille, dont les estimations varient de quelques nanomètres à plusieurs centaines de nanomètres.
De nombreux lipides et protéines membranaires sont concentrés dans des microdomaines (d’un diamètre supérieur à 1 µm) et nanodomaines (ou radeaux lipidiques, dont le diamètre est inférieur à 1 µm et fait plutôt entre 20 et 300 nm). En mesurant la viscosité des protéines dans la membrane plasmique des cellules, on a mis en évidence des compartiments, de 30 à 50 nanomètres de diamètre, délimités par des éléments du cytosquelette. Des radeaux de cette taille contiendraient environ 3 500 lipides et une dizaine de protéines. De nombreux modèles ont été proposés depuis, tel celui qui met en scène une mosaïque de radeaux de tailles et de compositions différentes. Un moyen de mettre en évidence ces structures est de favoriser leur assemblage, soit artificiellement grâce à un anticorps doté d'une molécule fluorescente établissant des ponts entre des protéines de radeaux différents, soit de façon plus physiologique avec une molécule reconnue par des récepteurs membranaires de surface. Ainsi, non seulement on « voit » des flottilles de radeaux agrégés, mais on suit aussi leurs effets, telle l'activation des voies de signalisation interne. Cette propriété d'auto-assemblage constitue la principale fonction des radeaux.
Les radeaux lipidiques dans l’immunité et la signalisation
La validation du concept de radeaux lipidiques est venue de l'étude de mécanismes immunitaires et, notamment, de ceux mis en œuvre au niveau des synapses immunologiques, c'est-à-dire quand une cellule présentatrice d'antigènes « apprend » aux autres acteurs de l'immunité quelle cible ils doivent attaquer. Détaillons le cas du récepteur de l'antigène des lymphocytes T. Lorsque l'organisme est contaminé par un micro-organisme, les antigènes de ce dernier sont présentés par des molécules dites du complexe majeur d'histocompatibilité portées par les cellules présentatrices d'antigènes. Quand un récepteur de l'antigène, porté par un lymphocyte T, reconnaît l'antigène présenté, le lymphocyte libère des cytokines, molécules qui coordonnent l'ensemble de la réponse immunitaire. Le récepteur des lymphocytes T met en jeu une série de molécules de signalisation associées à des radeaux qui, en se réunissant, permettent aux molécules d'interagir. Le ballet est initié par des protéines tyrosine kinases, des enzymes qui retirent ou ajoutent des groupes phosphate à des tyrosines. Les tyrosines kinases de la famille Src sont ancrées à des radeaux par des chaînes d'acides gras saturés sur la face intracellulaire de la membrane.
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Quand le récepteur de l'antigène est activé, un radeau doté de kinases Src se rapproche et entraîne la phosphorylation de fragments cytoplasmiques du récepteur. Cette phosphorylation a pour conséquence le recrutement d'autres tyrosines kinases, les kinases Syk, et de protéines transmembranaires, nommées LAT, elles aussi véhiculées par des radeaux. Ces protéines sont des « adaptateurs » qui, via des protéines effectrices et des cascades de signalisation, contrôlent la transcription de certains gènes nécessaires à l'activation du lymphocyte T. Ainsi, les radeaux favorisent la rencontre des acteurs moléculaires requis par les réactions immunitaires et leur permettent de rester ensemble suffisamment longtemps pour que la réaction ait lieu. Cependant, on ignore encore quelle force motrice met en mouvement ces radeaux. L'approfondissement du rôle du cytosquelette nous en apprendra certainement beaucoup. De plus, même si certaines protéines responsables de l'activation des réactions immunitaires sont indéniablement distribuées dans les radeaux, le rôle exact de ces derniers et leur nécessité dans la formation de la synapse demeurent des problèmes ouverts. Une autre énigme importante consiste à savoir comment le complexe immun est dissocié.
Mobilité cellulaire, chimiotactisme et guidage axonal
Les cellules se déplacent parfois dans un gradient chimique, c'est-à-dire qu'elles se meuvent en direction d'une « source » de molécules attractives. Le rôle des radeaux dans ce phénomène, nommé chimiotactisme, a été particulièrement étudié pour les leucocytes et les fibroblastes. Sous l'effet d'un signal, la cellule fabrique une protubérance qu'elle étend vers les régions où ce signal est le plus abondant, grâce à un assemblage de protéines du cytosquelette, l'actine. Dans ce prolongement cellulaire - le bord d'attaque -, une enzyme fabrique des lipides de type phophatidylinositol-phosphate qui recrutent des protéines spécifiques nécessaires au déplacement. L'analyse des cellules polarisées a révélé l'existence de plusieurs types de radeaux, situés, pour les uns, près du bord d'attaque et, pour les autres, à l'arrière, se distinguant par leur composition protéique et lipidique. Une telle discrimination entre différents types de radeaux n'est pas détectée dans les cellules non polarisées. Toute perturbation de l'intégrité des radeaux, par l'élimination du cholestérol par exemple, diminue la mobilité cellulaire. Élucider ces mécanismes serait essentiel à notre compréhension de la migration des cellules cancéreuses, notamment lors de la formation de métastases.
Un autre exemple de chimiotactisme est le guidage axonal. Afin d'établir des circuits neuronaux, les axones doivent parcourir de longues distances pour trouver leur cible et former des connexions interneurones. Au cours de leur voyage, les axones sont guidés par des signaux répulsifs et attractifs. Les effets de ces signaux, notamment du facteur neurotrophique, disparaissent après l'élimination du cholestérol membranaire, indiquant un rôle des radeaux dans ce phénomène. Par ailleurs, l'étude de l'amibe Dictyostelium a mis en évidence, sur les bords et à l'arrière de ces cellules mobiles, des enzymes spécifiques qui restreignent la production des phophatidylinositol-phosphate : l'absence de ces lipides entraîne celle des protéines requises pour le déplacement, qui est donc unidirectionnel. La membrane présente des organisations locales. Certaines sont stables, comme les synapses, d'autres sont éphémères et contingentes de la reconnaissance de signaux extracellulaires.
Organisation structurale et ancrage des protéines membranaires
Les protéines transmembranaires (intégrales, intrinsèques) possèdent une ou plusieurs structures secondaires organisées en domaines s’insérant au travers d’une membrane biologique. Les plus courants sont les hélices α transmembranaires, dont des radicaux d’acides aminés apolaires interagissent avec les lipides membranaires. D’autres protéines membranaires ont subi des modifications post-traductionnelles les liant de façon covalente à un lipide qui s’insère dans les membranes : liaison à un acide gras par acylation (par exemple un acide myristique ou un acide palmitique), prénylation, ou liaison à un glycolipide (par exemple une ancre GPI). Enfin, des protéines membranaires extrinsèques sont associées à la surface de la membrane via des liaisons faibles avec d’autres composants membranaires. Il peut s’agir d’une reconnaissance spécifique de lipides ou de protéines membranaires (reconnaissance biochimique), comme la protéine SidM injectée par les bactéries Legionella dans le cytoplasme des cellules infectées, qui reconnaît le PI4P (phosphatidylinositol-4-phosphate). Souvent, les protéines interagissent avec des zones de la membrane présentant des propriétés biophysiques particulières : champ électrostatique (charge) sous-membranaire, courbure, ou défauts d’agencement lipidique (packing defects) causés par la présence locale d’insaturations et de petites têtes polaires.
L’observation des composants membranaires peut également être indirecte, grâce à des protéines de fusion fluorescentes se liant à des lipides. Après avoir provoqué le photoblanchiment d’une petite zone de la membrane plasmique, on observe que cette zone redevient petit à petit fluorescente, témoignant de la diffusion latérale. De nombreuses protéines transmembranaires sont liées, via des protéines de liaison, au cytosquelette cortical des cellules : principalement les microfilaments d’actine et la spectrine dans les cellules animales, et les microtubules corticaux et microfilaments d’actine dans les cellules végétales. Dans les cellules animales au cytosquelette périphérique absent ou perturbé, la fluidité de la membrane plasmique augmente globalement à l’échelle micrométrique. Pourtant, à l’échelle nanométrique, la vitesse de diffusion latérale des lipides suivis individuellement n’est pas affectée. En fait, le cytosquelette sous-membranaire forme des « enclos » (corrals) constituant des domaines de diffusion latérale où les composants membranaires diffusent, mais dont ils sortent rarement.
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Barrières physiques et domaines de spécialisation membranaire
Des protéines membranaires ancrées au cytosquelette (et éventuellement à la matrice extracellulaire) se comportent comme des piquets. Du fait du fort potentiel hydrostatique (pression de turgescence) des cellules végétales, leur membrane plasmique est plaquée contre la paroi (matrice extracellulaire). Or, pour des protéines membranaires de la membrane plasmique possédant un domaine extracellulaire, la fluidité latérale à l’échelle microscopique augmente dans des protoplastes frais (cellules végétales sans paroi) ou dans des cellules plasmolysées (membrane plasmique décollée de la paroi). Le placage de protéines ayant un domaine extracellulaire contre la paroi inhibe donc leur diffusion latérale. La paroi agit comme « enclos », à la manière du cytosquelette, restreignant le domaine de diffusion des protéines membranaires. Dans les cellules animales également, la matrice extracellulaire peut contribuer à restreindre les possibilités de déplacement de protéines transmembranaires, par exemple via des interactions entre intégrines membranaires et fibronectines matricielles formant des « piquets ».
Les membranes biologiques présentent également des domaines de taille micrométrique. C’est le cas des domaines de croissance apicale chez les Angiospermes, ainsi que des sites de contacts entre membranes (membrane contact sites) où des membranes distinctes sont très proches (environ 10 nm). Les jonctions serrées des épithéliums animaux délimitent des domaines de diffusion latérale dans la membrane plasmique : un domaine apical et un domaine basolatéral. Ces jonctions forment un anneau dans la membrane plasmique des cellules épithéliales, et sont constituées notamment par les protéines transmembranaires claudines et occludines qui se lient entre elles et accolent ainsi les membranes plasmiques des cellules voisines, empêchant la diffusion latérale des protéines membranaires. Dans les racines des Angiospermes, le cadre de Caspary contraint les composés transportés depuis l’épiderme racinaire vers les tissus conducteurs.
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