La compartimentation membranaire et la genèse des microdomaines
La membrane cellulaire présente des organisations locales. Certaines sont stables, comme les synapses, d'autres sont éphémères et contingentes de la reconnaissance de signaux extracellulaires. C'est le cas des lipid rafts. Depuis 1972, on pensait que dans les membranes plasmiques, les phospholipides et les protéines membranaires étaient omniprésents selon un modèle en mosaïque fluide. Mais en 1988, Kai Simons, de l'EMBL en Allemagne, et Gerrit van Meer de l'Université d'Utrecht, aux Pays-Bas, ont proposé une idée nouvelle en ce sens qu'il existe des microdomaines enrichis en plusieurs types de lipides tels que le cholestérol, glycolipides et sphingolipides, tous présents dans les membranes plasmiques.
Un microdomaine est n'importe laquelle de plusieurs petites régions d'une membrane cellulaire qui a une structure distincte et une fonction distincte. Par exemple, une bordure en brosse de cellules épithéliales. Les microdomaines membranaires, souvent appelés radeaux lipidiques, sont des sous-domaines spécifiques des membranes cellulaires enrichies en cholestérol et en sphingolipides contenant des chaînes acyles saturées. Ces microdomaines sont dus aux interactions du cholestérol avec des chaînes acyle saturées qui entraînent un compactage serré de ces lipides par rapport aux phospholipides, qui sont riches en chaînes acyle coudées et insaturées. Ce tassement lipidique différentiel induit la formation d'une phase liquide ordonnée (Io) et d'une phase liquide désordonnée (Id) plus lâche.
Le cholestérol joue un rôle critique dans la régulation du comportement de phase; au delà d'une concentration seuil, la phase Io est favorisée. La formation de la phase Io est également renforcée par des liaisons hydrogène intermoléculaires qui se forment entre les sphingolipides. L'enrichissement en sphingolipides dans le feuillet externe de la PM donne un domaine Io qui "flotte" dans le domaine Id environnant, d'où le terme "radeaux lipidiques".
Un radeau lipidique est un microdomaine d'un membrane, la membrane plasmique, dont la fluidité est bien inférieure à celle de son environnement. Les radeaux lipidiques sont enrichis en cholestérol, en phospholipides saturés et en protéines membranaires. Bien que leur taille soit variable, ils mesurent généralement environ 50 nm de diamètre. Ces groupes forment une phase lipidique plus dense que les glycérophospholipides et constituent ainsi des zones spéciales de la membrane plasmique qui fonctionnent comme des "radeaux" flottant parmi tous les autres lipides. Ces unités de la membrane plasmique ont une taille et une composition très diverses et dynamiques, et sont associées à des protéines membranaires qui leur confèrent des propriétés et des fonctions différentes. Par conséquent, en tenant compte de ces pools lipidiques, nous devrions considérer la membrane plasmique comme un composant cellulaire hétérogène dans lequel se trouvent de nombreux pools lipidiques dont les propriétés changent et définissent différentes fonctions dans les régions de la membrane cellulaire.
Structure et distribution moléculaire des constituants membranaires
Le concept original de radeaux a été utilisé pour expliquer le transport du cholestérol du réseau Trans-Golgi vers la membrane plasmique. L'idée a été formellement développée en 1997 par Simons et Ikonen. Dans un modèle simplifié de structure de radeau lipidique dans les membranes cellulaires et leurs microdomaines, les phospholipides (marron et rouge) et le cholestérol (jaune) sont distribués dans les deux feuillets, tandis que les sphingolipides (violet) sont enrichis dans le feuillet externe de la bicouche. Un sphingolipide peut disposer de quatre radeaux lipidiques de la membrane plasmique. Les chaînes acyle des radeaux lipidiques sont généralement longues et saturées (violet et rouge), tandis que celles des microdomaines non radeau sont plus courtes et contiennent une ou deux chaînes acyle insaturées (marron).
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Les microdomaines de radeau contiennent des concentrations de protéines ancrées au glycosylphosphatidylinositol (GPI) (orange), tandis que les protéines transmembranaires (bleu) et prénylées (bleu) ne sont généralement pas associées au radeau. Les radeaux lipidiques sont des microdomaines moléculaires situés dans la membrane plasmique, constitués d'associations stables entre les sphingolipides, les glycolipides et le cholestérol. Les radeaux lipidiques sont des microdomaines membranaires plasmiques enrichis en cholestérol et en sphingolipides qui interviennent dans la compartimentation latérale des molécules à la surface cellulaire. L'internalisation des ligands et des récepteurs par ces domaines intervient via un processus défini comme l'endocytose dépendante du radeau.
Entre autres fonctions, les microdomaines membranaires latéraux servent de plates-formes pour concentrer des protéines membranaires spécifiques dans un milieu adéquat pour leur conformation réelle. Pour de nombreuses protéines, comme les capteurs membranaires, les récepteurs ou certains transporteurs, il a été documenté que l'accumulation locale au niveau de la membrane améliore considérablement leur activité. Par conséquent, une cellule avec des membranes compartimentées latéralement est plus efficace biologiquement, mesurée en termes de survie cellulaire, de résistance au stress, de durée de vie chronologique, etc.
Méthodes d'isolement biochimique et caractérisation expérimentale
Ces microdomaines lipidiques, en raison de leur insolubilité dans un détergent non ionique à basse température, peuvent être isolés biochimiquement en tant que complexe répresseur transcriptionnel (DRM). En raison de leur forte teneur en lipides, les complexes DRM flottent à faible densité dans des gradients de densité de saccharose. L'isolement de DRM a été largement utilisé pour identifier les protéines associées aux radeaux lipidiques. Les protéines qui ont tendance à résider dans ces microdomaines comprennent des protéines acylées seules ou multiples telles que les protéines G et certaines tyrosine kinases qui résident généralement dans le feuillet interne et les protéines ancrées au glycosylphosphatidylinositol (GPI), qui sont attachées au feuillet externe des microdomaines membranaires. Une mise en garde majeure à l'approche d'isolement DRM est que le traitement au détergent froid peut provoquer l'agrégation des domaines membranaires.
Il a été observé que certaines protéines liées aux processus de signalisation cellulaire sont associées aux radeaux lipidiques. Ce type comprend les protéines marquées au glycosylphosphatidylinositol (GPI), les tyrosine kinases à double acylation de la famille Src et les protéines transmembranaires. L'association, au moins partielle, des queues insaturées et acylées des tyrosine kinases et des protéines ancrées aux GPI peut également intervenir dans cette association, qui sont plus en accord avec les propriétés des sphingolipides que le reste de la membrane (Simons et Ikonen, 1997). Bien que ces protéines tendent à être présentes en permanence dans les radeaux lipidiques, d'autres ne les associent que lorsque ces protéines sont activées. Certains exemples incluent, sans toutefois s'y limiter, les récepteurs des lymphocytes B (BCR), les récepteurs des cellules T (TCR), les PAG et une enzyme appelée CD39. D'autres protéines sont exclues des radeaux lipidiques, telles que le récepteur de la transferrine et un membre de la famille Ras. Généralement, l'inclusion ou l'exclusion de protéines est déterminée par le fait qu'elles se trouvent dans des fragments de membrane extraits à l'aide de triton (selon la définition des radeaux par DRM).
Les chercheurs ont testé la présence et l'importance des radeaux lipidiques dans la signalisation cellulaire en comprenant d'abord les processus initiaux de signalisation, puis en modifiant les radeaux lipidiques, puis en observant tout changement dans la fonction cellulaire. Les radeaux lipidiques sont généralement modifiés en éliminant le cholestérol de la membrane à l'aide de systèmes tels que la méthyl-β-cyclodextrine ou d'antibiotiques tels que la filipine. Dans les lymphocytes B normaux, lorsque la cellule trouve un antigène, les récepteurs des lymphocytes B sont transférés dans un domaine lipidique balsa, qui transmet un signal qui provoque la prolifération cellulaire dans les plasmocytes et produit des anticorps. Cependant, lorsque le cholestérol a été éliminé des lymphocytes B, détruisant vraisemblablement les radeaux lipidiques, les récepteurs des cellules B n'étaient plus en mesure de relayer le signal qu'ils avaient trouvé un antigène et aucun anticorps n'a été produit. De même, lorsque les radeaux ont été éliminés des lymphocytes T, les TCR ont également perdu leur capacité à transmettre des signaux lorsqu'ils ont trouvé un antigène. L'élimination des radeaux a également affecté la fonction de CD39, une enzyme qui joue un rôle dans l'agrégation plaquettaire.
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Techniques avancées d'imagerie et d'observation microscopique
Du fait de leur taille inférieure à la limite de diffraction classique des microscopes optiques, les radeaux lipidiques sont difficiles à visualiser directement. Malgré cela, la microscopie à fluorescence est largement utilisée dans ce domaine. Par exemple, les fluorophores conjugués à la sous-unité B de la toxine cholérique, qui se lie à un composant du radeau appelé ganglioside GM1, sont largement utilisés. Les colorants membranaires lipophiles sont également utilisés dans un des territoires de la membrane cellulaire, soit dans les radeaux, soit dans la majeure partie de la membrane, ou modifient leurs propriétés de fluorescence en réponse aux phases membranaires. Le Laurdan est l'un des premiers exemples de ce dernier type de colorant. Les radeaux peuvent également être marqués par l'expression génétique de protéines de fusion fluorescentes telles que Lck-GFP (Lck lié à la protéine fluorescente verte).
Pour lutter contre les problèmes de petite taille et de nature dynamique, le suivi des particules et des molécules individuelles au moyen de caméras CCD sensibles refroidies et de la microscopie à réflexion interne totale (TIRF) prend de l'importance, ce qui permet d'obtenir des informations sur le pouvoir de diffusion des particules de la membrane tout en observant des barrières et des lieux de confinement. D'autres techniques optiques telles que la corrélation de fluorescence et la corrélation croisée de la spectroscopie (FCS/FCCS) peuvent être utilisées pour obtenir des informations sur la mobilité des fluorophores dans la membrane. Le transfert d'énergie par résonance fluorescente (FRET) permet de détecter les fluorophores à proximité et les techniques de pincement optique peuvent fournir des informations sur la viscosité de la membrane. Les microscopes à force atomique (MFA), les microscopes à balayage à conductance ionique (SICM) et la résonance magnétique nucléaire (RMN) sont également utilisés. En Espagne, cette dernière technique est utilisée pour observer la structure des radeaux dans les installations en phase liquide du laboratoire de biotechnologie de l'université Miguel Hernández d'Elche. Cependant, la technique la plus couramment utilisée est la microscopie à fluorescence. À l'avenir, on s'attend à ce que la microscopie à super-résolution telle que l'épilation par émission stimulée (STED) ou diverses formes de microscopie à illumination structurée puissent résoudre les problèmes posés par la limite de diffraction. Le laboratoire Kusumi est l'un des leaders dans l'étude des radeaux lipidiques.
Controverses scientifiques et limites méthodologiques
Le rôle des radeaux dans la signalisation, le trafic et la structure cellulaire reste à déterminer, en dépit des nombreuses expériences incluses dans les différentes méthodologies. Parmi les arguments contre l'existence de radeaux lipidiques figurent les suivants :
- Premièrement, il doit y avoir une ligne de tension entre les phases La et Lo. Cette ligne a été observée dans les membranes modèles, mais pas encore dans les systèmes cellulaires.
- Deuxièmement, il n'y a pas de consensus sur la taille des radeaux lipidiques, dont il a été publié qu'elle pourrait être comprise entre 1 et 1 000 nanomètres.
- Troisièmement, l'échelle temporelle de l'existence de radeaux lipidiques est inconnue. Si des radeaux lipidiques existent, cela ne peut exister que sur une échelle temporaire sans rapport avec les processus biologiques.
- Quatrièmement, toute la membrane peut être en phase Lo.
Une première réfutation de ce dernier point suggère que la phase basse des radeaux est plus compacte en raison des liaisons hydrogène intramoléculaires qui interviennent entre les sphingolipides et le cholestérol et n'est pas visible partout. Un deuxième argument remettrait en question l'efficacité des modèles expérimentaux lorsque les radeaux lipidiques sont modifiés. Pike et Miller ont discuté des principales difficultés rencontrées lors de l'utilisation de l'épuisement du cholestérol pour déterminer la fonction des radeaux lipidiques. Ces chercheurs ont commenté que la plupart des chercheurs utilisaient des méthodes aiguës d'appauvrissement en cholestérol, qui altéraient les radeaux, mais aussi un autre lipide appelé PIP (4,5) P2. Ceci joue un rôle important dans la régulation du cytosquelette et l'altération de la PIP (4,5) P2 provoque également bon nombre des mêmes résultats de ce type de déplétion du cholestérol, y compris la diffusion latérale des protéines membranaires.
Rôle physiologique et pathologique des radeaux lipidiques
Les radeaux lipidiques interviennent dans un grand nombre de fonctions cellulaires (et de plus en plus sont découvertes), telles que la réponse à l'invasion d'agents pathogènes, l'homéostasie du cholestérol, l'angiogenèse, la transduction de signal, etc. Les radeaux ont été impliqués dans d'autres processus et systèmes physiologiques et pathologiques. Cela inclut la signalisation cellulaire, le trafic moléculaire et la fonction des systèmes vasculaire, digestif et reproducteur. La pathogenèse de maladies telles que le SIDA (viral), la salmonellose (bactérienne) et le paludisme (parasite eucaryote) a été liée au rôle des radeaux. Typiquement, cela implique de "séquestrer" la fonction des radeaux des cellules hôtes par l'agent pathogène à leurs propres fins, par exemple pour accéder à l'intérieur de la cellule hôte.
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Ceux-ci consistent en un rassemblement en un point précis de plusieurs protéines membranaires, lorsque ces dernières reconnaissent un ligand extracellulaire. Ce rassemblement est stabilisé par l'accumulation au même point de cholestérol et de lipides rigides, comme les glycosphingolipides. Au cours du développement, le guidage axonal et la migration neuronale sont intimement dépendants de ces structures. De récentes études ont montré que les radeaux lipidiques modulent le guidage axonal assuré par le couple DCC/nétrine-1.
Le concept de récepteurs à dépendance
Il est classiquement admis qu’un récepteur est uniquement actif lorsqu’il interagit avec son ligand. La famille des récepteurs dits « à dépendance » est l’exception qui confirme la règle. En effet, en présence de ligand, ces récepteurs induisent des signaux de prolifération, différenciation ou migration, mais ils sont également actifs en absence de leur ligand puisqu’ils induisent la mort de la cellule par apoptose. Ces récepteurs sont donc dits « à dépendance » car une cellule qui les exprime devient dépendante de la présence du ligand pour survivre.
Le récepteur DCC (deleted in colorectal cancer) est un récepteur transmembranaire initialement décrit comme un potentiel suppresseur de tumeurs car son expression est perdue dans 70 % des cancers colorectaux ainsi que dans de nombreux autres cancers. Le récepteur DCC n’est pas seulement impliqué dans les processus tumoraux puisqu’au cours du développement, via l’interaction avec son ligand, la nétrine-1, il contrôle le guidage axonal et la migration neuronale.
Le récepteur DCC comme suppresseur de tumeurs et son interaction ligand-dépendant
Le récepteur DCC est un suppresseur de tumeurs présomptif qui contrôlerait l’échappement tumoral en induisant l’apoptose des cellules qui se retrouvent déficitaires en nétrine-1 car elles ont proliféré ou migré vers d’autres tissus dépourvus de nétrine-1. La perte d’expression du récepteur et la surexpression ou l’expression autocrine de nétrine-1 seraient des avantages sélectifs pour le développement tumoral.
Si l’activité suppresseur de tumeurs de DCC n’est pas encore formellement démontrée, il semblerait que DCC prévienne l’échappement tumoral en éliminant par apoptose les cellules cancéreuses. En effet, les cellules tumorales prolifèrent intensément dans un environnement où la concentration en nétrine-1 reste constante, les cellules seraient donc en déficit de nétrine-1 et DCC déclencherait leur apoptose. De la même manière, une cellule tumorale métastatique qui quitterait le site primaire de tumorigenèse pour envahir d’autres tissus perdrait la nétrine-1 et entrerait alors en apoptose. Ainsi, une perte d’expression de DCC, suite à une perte d’hétérozygotie ou à la méthylation du promoteur, serait un avantage sélectif qui rendrait les cellules résistantes à l’absence de nétrine-1. De même, une surexpression de nétrine-1 par les cellules environnantes ou par les cellules tumorales elles-mêmes permettrait aux cellules cancéreuses de proliférer ou d’envahir d’autres tissus.
Mécanismes de localisation de DCC dans les radeaux lipidiques
Un article émanant d’un travail collaboratif entre le groupe de A.O. Hueber et le nôtre révèle que la localisation de DCC dans les radeaux lipidiques est cruciale pour l’induction de l’apoptose. En effet, le récepteur DCC est partiellement associé aux radeaux lipidiques. Cette localisation ne dépend pas de la nétrine-1 mais de l’ajout post-traductionnel d’un acide palmitique sur une cystéine localisée à l’extrémité du domaine transmembranaire du récepteur. Si cette cystéine est remplacée par une valine, DCC n’est plus palmitoylé et n’est donc plus associé aux radeaux lipidiques.
Cette localisation de DCC dans les radeaux lipidiques est importante car une altération des rafts par dégradation du cholestérol ou des sphingolipides réduit fortement son activité pro-apoptotique, aussi bien dans des cellules transfectées que dans des neurones spinaux qui expriment DCC de manière endogène.